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中药材DNA条形码鉴定系统

发布时间:2019-12-18 16:38:49 所属栏目:物联网 阅读:

    中药材品种混乱及真伪鉴定方法欠缺严重影响中医药的疗效与安全。陈士林课题组在国际科技合作等项目的资助下,通过近十年的潜心研究和大量筛选实验,在国际上首先发现并验证核基因组ITS2序列(长度约220bp),适于鉴定中药材等存在DNA降解的材料。首次提出核基因组ITS2序列作为中草药通用DNA条形码,创建了崭新的中草药DNA条形码生物鉴定体系,并构建了较完备的中草药DNA条形码网络鉴定数据库。
     DNA 条形码概念自2003 年由加拿大分类学家Paul Hebert 首次提出后受到了各国分类学家的广泛关注。然而,要对所有物种进行快速识别,首先要给自然界的所有物种建立DNA 条形码数据库,这是一场浩大的工程。中科院昆明动物所所长张亚平院士说:传统的分类学鉴定费时费力,又可能出现错误。如果每一个物种都携带有表明自己身份的条形码,那么物种分类和鉴定工作将得到很大简化Gregory 认为全球性的DNA 条形码创新研究将成为继人类基因组计划后又一大科学计划。尽管DNA 条形码技术在理论上和具体应用上仍存在很多争论,但该技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的束缚,其在中药鉴定中的成功应用将带来生药鉴定方法的革命性突破。
  DNA 条形码(DNA barcoding)技术已被学术刊物和其他媒体大量报道,如ScienceNaturePNAS,利用这一方法可以进行物种的区别和鉴定,发现新种,并有可能解决形态学手段难以攻克的隐存种问题,完成一些传统形态学及保护生物学无法完成的工作,对缓解传统鉴定人才的缺乏和药材鉴定困难极为必要,该方法不需要多年经验积累,鉴定技术易于掌握,可以满足不同行业不同科研背景工作者对中药快速鉴定的要求。利用 DNA 条形码技术得到的研究结果在不同物种之间具有可比性,而且它操作的简便性和高效性将以我们无法想象的速度加快物种鉴定和分类进化研究的步伐。Miller 在《PNAS》发表了题为“DNA barcoding andthe renaissance of taxonomy”,提出DNA 条形码鉴定技术正在推动分类学的文艺复兴DNA 条形码技术通过建立鉴定数据库,容易数字化,短时间即可掌握,易于推广,这是传统医药走向国际化的巨大推动力。DNA 条形码技术方法易于统一、标准化,是中药分子鉴定方法学上的创新。
  1. DNA 条形码的原理
  因为每个物种的 DNA 序列都是唯一的,DNA 条形码通过测定基因组上一段标准的、具有足够变异的DNA 序列来实现物种鉴定。理论上这个标准的DNA 序列对每个物种来讲都是独特的,每个位点都有ATG四种碱基的选择,15 bpDNA 序列就有415 种组合编码,从理论上来讲完全可以编码地球上的所有物种。
  2. DNA 条形码筛选标准
  自DNA 条形码的概念提出后,随之明确了DNA 条形码的选择标准:①标准的短片段;②要有足够的变异可将物种区分开来。作为DNA 条形码的序列必须是种间差异比较大,便于进行种与种的区分;种内序列变异尽量小,从而使种间和种内变异有一个很明晰的界定;③序列两端相对保守,以方便引物的设计。
  3. 中药DNA 条形码鉴定的意义
  (1DNA 条形码鉴定技术是传统鉴定方法的有效补充四大经典的鉴定方法包括原植物(原动物)、性状、显微、理化鉴定,在我国中药的基原鉴定中发挥过巨大作用。原植物(原动物)鉴定方法是中药基原鉴定的基础,但直接用于中药材及其饮片的鉴别有一定难度。性状、显微、理化等鉴定方法可以确定部分中药的基原品种,但难以区别开大部分来自近缘物种的中药材和中药饮片,理化鉴定方法因中药活性成分的含量受到其生长条件、采收时间、贮藏等因素的影响而发生变化,容易影响鉴定结果的准确性,同时亲缘关系较近的物种化学成分相似而难以区分。与传统的鉴定方法相比较,DNA 条形码技术用短的、标准的DNA 片段作为物种标记进行鉴定,不受个体形态、大小等特征和完整性的影响,能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据,可以实现对中药材原植物、饮片、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确鉴定,尤其适合以不同部位入药的中药材的物种鉴定。例如通过对药用植物的部分叶片、种子或粉未、药用真菌的菌丝、孢子,以及药用动物的毛发、血液或部分组织等,提取较为完整的DNA,利用通用引物扩增短的DNA 条形码序列可实现动植物物种的快速准确鉴定。这不仅能弥补经典鉴定方法的不足,而且能推动传统形态分类工作的深入发展,是传统鉴定方法的有效补充。
  (2)建立中药DNA 条形码数据库实现中药基源鉴定的标准化
  不同物种形态的差异归根结底都可追溯到 DNA 序列上的差异,因此,对基因序列差异的比较无疑为植物分类和中药鉴定提供了最本质的依据。DNA 条形码使用通用引物实现对物种的快速鉴定,是目前国际上物种鉴定的最新技术,能够构建国际共享的技术平台。每一个物种某些片段的核苷酸序列对应在一定范围内变化,通过世界范围内科学家的共同努力,可迅速积累大量不同物种各个片段的核苷酸序列组成数据库,形成国际统一的物种鉴定标准。这可为我国药用植物和中药提供明确的物种、特别是近缘物种的鉴别信息。将DNA 条形码序列数据与计算机信息系统结合起来,可促进DNA 条形码技术操作的程序化和规范化,实现中药鉴定的标准化和自动化,对中药品种监管工作带来极大便利。
  (3)中药DNA 条形码鉴定方法有助于缓解鉴定人才缺乏的现状
  传统鉴定方法,尤其是形态分类学鉴定和性状鉴定方法,需要鉴定人员具有较高的专业知识和长期的经验积累,可能需要专攻某一个领域相当长的时间。擅长某一具体类群的植物分类或中药材的鉴定工作已实属不易,但实际鉴定工作需要面对纷繁复杂,种类繁多的中药材其鉴定难度更大,同时分类和鉴定人员的主观判断能力能极大影响其鉴定结果的准确性。DNA 条形码鉴定技术程序固定,易于操作,通过构建中药DNA 条形码序列数据库,任何人可以方便地进行数据比对完成鉴定工作,只需相关人员了解相关分子生物学背景知识,实际动手操作一段时间,即可掌握该项鉴定技术。目前传统鉴定人才的缺乏难以满足卫生行业快速发展的需求,该技术的引入对缓解传统鉴定人才缺乏具有现实意义。
  (4DNA 条形码技术促进中药新资源的开发利用
  随着现代中药工业的发展,药用植物濒危物种逐年增加,濒危中药资源的开发利用面临着资源短缺问题。寻找新的药源及替代品成为中药资源研究的一个重要方向。亲缘关系相近的药用动植物往往含有相同的化学活性物质,经典的中药资源调查方法一般是在同属植物中广泛寻找,并结合每种植物化学成分的分析进行确定,比较费时费力。可以通过DNA 条形码序列构建系统发育树确定物种间的系统发育关系、分化过程及进化地位,验证动植物及其高级阶元的系统演化,还可应用多个条形码序列同时进行分析,从分子水平探讨物种间的遗传关系,发现分子水平上密切联系的物种,从而发现可替代的新的资源物种,这将大为加快中药新资源寻找的进程。DNA 条形码技术在寻找濒危中药新药源研究中是药用植物亲缘学和化学分类学的有力补充。
  (5DNA条形码技术对中药资源生物多样性的保护
  中药资源的生物多样性是中药资源评价的重要的指标之一。生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性。遗传多样性主要通过遗传标记的多态性来反映。遗传变异体现在不同的水平上:群体水平、个体水平、组织水平和细胞水平及分子水平,而DNA 分子结构的突变是遗传多样性的主要来源。遗传标记根据检测技术和内容不同可分为:形态学标记、细胞学标记、同工酶标记和DNA标记等。目前遗传多样性研究中应用较多的分子标记技术主要有RFLPRAPDAFLPISSRSRAP 等。这些分子标记方法在理论上或实际应用中都有各自的优势和局限性。在生物多样性评估中,DNA 条形码技术基于DNA序列本身,结果比传统形态分类更准确快捷,可以快速完成物种的区别和鉴定,发现新种和隐存种,重建物种和高级阶元的演化关系。它将完成一些传统形态学鉴定手段无法完成的工作,比如可以鉴定生物的卵和幼体、动物或植物的寄生物,这一优势对中药资源保护生物学和生物多样性研究具有重大意义。在兰科药用资源生物多样性研究中,利用DNA 条形码技术兰科分类学者可以鉴定在传统分类方法尤其是形态学上难以区分的物种或品系,甚至组织和幼株,作为一种辅助性工具来鉴定在分类地位上有争议的物种,对濒危植物的生物多样性保护具有现实意义。DNA 条形码技术亦可加快发现新种的速度,并有可能解决形态学手段难以攻克的隐存种问题,揭示动植物隐存多样性,例如Nitta 利用rbcLtrnH-psbA组合条形码成功鉴定出膜蕨新种Polyphlebium borbonicum
  (6DNA 条形码技术在中药材流通管理
  随着信息科学技术的发展,二维码自动识别技术得到了广泛的应用,由于它具有数据容量大,编码范围广(可以把图片、声音、文字、签字和指纹等可以数字化的信息进行编码,用条形码表示出来)等特点,大大提高了各行业的生产工作效率。二维码具有信息随载体移动,可以不依赖数据库和计算机网络而独立运行。二维DNA 条形码技术将二维码作为DNA 的信息载体,并利用日益普及的携带摄像/扫描功能的通信终端、带宽以及覆盖面积不断扩大的无线网络使得待鉴定对象的信息采集与传输都变得更加简单方便,是一种物种移动鉴别系统,能够实现以移动方式进行物种信息的采集和识别,使得物种鉴别更为方便快速。在我国,中药材主要都是在大型的药材市场中流通,即使排除中药材的人为掺假等因素,同种药材由于品种(有的药材为多基原品种)、产地、加工、运输、贮藏等的不同,其质量差异很大,这种差异导致了市场的不平衡以及不正当竞争,同时还造成了中药资源的浪费。中药材市场流通中缺乏符合生产实际的、与市场流通配套的、行之有效的中药材质量量化评价标准。针对市售中药材在流通领域可能面对的各种问题,可以将二维DNA条形码技术运用于中药材流通管理领域中。在中药二维DNA 条形码管理模式中,首先将获取某种药材的DNA 条形码序列,将其按照一定的编译规律转换成二维码,建立二维码与中药DNA 条形码序列及药材名称相对应的数据库,然后将中药二维DNA 条形码应用于中药生产流通的整个环节中,消费者可以利用照相机或手机获取二维条形码信息,然后将二维条形码图像传到电脑,与标准数据库比对进行解码,或通过手机内建的读码软件进行解码,从而进行中药的鉴定,获知其物种信息及来源信息,转化为药材名称。目前中国医学科学院药用植物研究所联合北京航空航天大学已经突破了DNA条形码序列转换为二维码的编码,以及将二维码转换为DNA 序列的解码技术,建立了相应的数据库和网站。这种二维码识别方式能够对中药生产和流通环节进行有效的管理,同时将给中药材流通管理带来巨大的革新。
  4. DNA 条形码研究进展
  目前一段长度约 650 bp 的线粒体基因COI(或cox1)被Paul Hebert 选作动物DNA 条形码,因为COI 在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增,其DNA 序列本身很少存在插入和缺失。同时,它还拥有蛋白编码基因所共有的特征,即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响,可以自由变异。因此,在一些昆虫、鱼类和鸟类的鉴定研究中得到了较好的验证。然而,植物条形码序列的确定还存在一定的争议,而且关于形态学分类修订和植物条形码相结合的研究较少;另外植物DNA 条形码筛选研究中同一种内的取样个体数量也不足,应该涉及多产地样品的取样,综合建立该物种的一致序列(consensus sequence)。
  Lahaye分析了以兰科为主的1600 份植物的DNA 序列,提出matK 基因可以揭示出隐存种,认为该条形码可有效鉴定CITES 条约中列举的濒危植物物种。相对于其他基因组来讲,叶绿体基因组进化较慢,单一条形码可能提供不了足够的变异,可以选择复合序列进行鉴定。然而,由于研究材料不同,得出的结论也有所不同。Kress Erickson 认为psbA-trnH rbcL 序列适合作为植物的条形码;而Chase 等提出rpoC1rpoB matK 组合,或者rpoC1matK psbA-trnH 组合作为植物条形码;2009 年国际条形码协会植物工作组提出matK rbcL 组合作为植物通用的条形码序列;但这对条形码组合针对属内物种水平的分辨率较低。在大量的分类群中找到合适的DNA 序列作为DNA 条形码具有一定的挑战性,发现进化速率较快、分辨率高且通用性好的条形码仍然是目前工作的重点。因此,应根据具体情况采用通用标记与专一标记共存的方法,分层次(如科、种和种下等级)寻找最适合的DNA 条形码,是当前的植物条形码研究策略之一。陈士林课题组自 2006年开始DNA 条形码的探索研究,通过与英国皇家植物园Kew 中草药鉴定中心和香港大学的国际科技合作,对6000 余份药用植物样本进行DNA 条形码序列筛选,研究表明核ITS2 序列的鉴定能力优于国际条形码协会植物工作组提出的matK rbcL 组合,首次提出将ITS2 作为药用植物鉴定的通用条形码序列。同时,验证了ITS2 对蔷薇科、大戟科、菊科、豆科等多个科属密切相关种的鉴定能力。进一步研究表明ITS2 在大于万份植物样本和大于万份动物样本中具有较强的鉴定能力。在前期大量研究的基础上,构建了以ITS2 为核心,psbA-trnH 为补充序列的植物类药材DNA 条形码鉴定体系和以COI 序列为核心,ITS2 为辅助序列的动物类药材DNA 条形码鉴定体系,并建立中药材DNA 条形码鉴定网站(
),为广大科研工作者直接应用DNA 条形码技术鉴定中药材搭建了一个平台。
  5. DNA 条形码组织机构及其发展历程
  国际条形码联盟(The Consortium for the Barcode of LifeCBOL)是致力于发展全球生物物种鉴定标准的国际性机构,从2004 年成立以来已经有来自50 个国家的200 多个组织成为其会员()。2005 月,由CBOL和英国自然历史博物馆主办的生命条形码协会第一次国际会议在伦敦召开,2007月第二届生命条形码大会在台北召开,这两届会议确立COI 做为通用的动物条形码序列,而针对植物条形码序列则没有达成统一意见。2009 11 月在墨西哥城召开第三届国际条形码会议,目的是对植物条形码形成共识并形成优先研究领域。CBOL 决定将叶绿体matK rbcL 组合作为植物的核心条形码,建议叶绿体psbA-trnH 片段和核基因片段ITS/ITS2 为植物DNA 条形码的补充条形码继续进行评估,并在今后一年半时间内对这两个条形码进行评估。随着植物标准条形码中核心条形码片段的确定,目前植物DNA 条形码研究的发展趋势正由植物DNA 标准条形码的筛选向分层次(如科、属、种和种下等级)寻找最适合的条形码、以居群为基础的条形码分析与系统学的比较、不同产地样品的条形码分析与生态学结合等方向发展。这三次国际会议对在全球推进DNA条形码研究计划起到了重要作用。
  6. DNA 条形码研究计划
  国际条形码协会建立了数据库工作组全球生物多样性信息设备,并和其他机构一同建立起DNA 条形码记录的数据标准。满足上述标准的数据将带有“BARCODE”记号。每个Barcode 记录均分配了一个被认可的物种名称,并与博物馆等储存机构的凭证标本建立电子链接,每条记录还包括PCR 引物、DNA 测序峰图文件。以上数据标准可保证BARCODE 记录成为鉴定生物样本的最佳手段。
  国际生命条形码的研究在 2003 年提出后,我国的DNA 条形码研究也快速跟进。中国医学科学院药用植物研究所在获国际科技合作项目和卫生部行业专项基金支持下,对适合药用植物鉴定的DNA 条形码开展了大量的研究工作。2008 4月,中科院与国际生命条形码联盟(iBOL)签订了合作谅解备忘录;2008 月,中国科学院成立了国际生命条形码中国委员会;2008 月,中国科学院和科技部分别启动国际生命条形码——中国项目预研重要生物DNA 条形码系统构建项目。2009 日至日,由中国科学院牵头在北京举行了中国植物DNA 条形码小型会议,会议决定成立中国植物DNA 条形码分委员会,负责制定中国植物DNA 条形码计划的科学目标和工作计划等任务。2009 11 日,中国植物DNA 条形码分委员会第一次全体会议在北京召开,成立了中国植物DNA条形码工作组。2009 月,召开了依托国家重大科学装置——种质资源库的开放研究项目植物DNA 条形码研究启动会,建立了中国DNA 条形码信息系统和生命条形码联盟中国镜像网站。中国医学科学院药用植物研究所建立了ITS2 鉴定植物和动物的网站
,同时建立了中药材DNA 条形码鉴定网站。