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基因突变关联性分析

发布时间:2021-01-16 00:01:54 所属栏目:物联网 阅读:

疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传播寄生虫病,以恶性疟最为严重,据WHO统计,2015年全球约有2.14亿疟疾病例,死亡约43.8万例,非洲死亡病例约占88%[-]。20世纪50年代末抗氯喹恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)先后在东南亚、南美地区出现,并传播迅速,其抗药性从单药抗性向多药抗性发展,使疟疾防治更加艰难[]。目前,恶性疟原虫的药物抗性在分子水平上的研究有较大进展,所有抗药性株均在位于7号染色体上恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(P. falciparum chloroquine resistant transporter gene,Pfcrt)Pfcrt76位点发生了点突变,位于5号染色体上的恶性疟原虫多药抗性基因1(P. falciparum multidrug resistance 1 gene,pfmdr1)不同程度的点突变可导致疟原虫对氯喹产生不同程度的抗性[-],并认为氯喹抗性由多基因位点变异所致[-]。本研究采集从非洲、东南亚等疟疾流行区回国人员的疟疾现症患者血样,应用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-RFLP)检测Pfcrt和pfmdr1基因点突变,探究输入性恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因多态性及其关联性。

1 材料与方法 1.1 样本采集

采集对象为2009—2016年非洲和东南亚等疟疾流行区确诊为恶性疟回国患者。采集患者手指或耳垂血,制作约ϕ1.2 cm的滤纸血斑,滤纸血自然干燥后封入塑料袋,4 ℃保存。

1.2 流行病学调查

收集患者姓名、性别、年龄、工种、出国国家、国外停留时间、患者症状、体征及用药和治疗情况等资料。按临床症状重轻分重度和轻度2种,有重度贫血、溶血、休克、肺水肿、肝肾功能衰竭和脑损害等症状为重度;仅寒战、发热、盗汗及胃肠反应等症状,但无并发症为轻度[]。本调查获得武汉市CDC伦理委员会的认证,获得了患者的知情同意。

1.3 仪器和试剂

PTC-200 Peltier Thermal Cycler梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司);Gene Genius Bio-Imaging System凝胶成像系统(英国Syngene公司);ColeParmer28560-00电泳仪(美国热电公司)。Taq DNA聚合酶购自加拿大BioStar公司,100 bp DNA标志物购自华美生物工程有限公司,dNTP购自美国Pharmacia公司,ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv限制性内切酶购自欧洲联盟Fermentas公司,琼脂糖购自法国BIOWEST公司,PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 PCR模板的制备

滤纸血剪成约3 mm×3 mm,置1.5 ml离心管中,按文献[]操作,恶性疟原虫模板于20 μl无菌蒸馏水保留,-20 ℃保存。

1.5 巢式PCR扩增Pfcrt和pfmdr1

根据Pfcrt和pfmdr1基因相关位点设计引物,分别扩增出含有Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点氨基酸目的片段,引物序列见。PCR反应体系和反应条件按文献[]操作。

表 1 Pfcrt和pfmdr1基因的巢式PCR引物及预期片段 Table 1 Pfcrt and pfmdr1 gene primers for nested PCR and length of products

 

1.6 扩增产物酶切

取第2轮PCR扩增产物10 μl,缓冲液2 μl,限制性内切酶0.5 μl,用ddH2O补充至20 μl,37 ℃过夜,取8 μl酶切产物电泳,观察结果。ApoⅠ酶切Pfcrt76扩增产物,酶切后野生型和突变型基因片段长度分别约为100和134 bp;ApoⅠ酶切pfmdr186扩增产物,酶切后野生型和突变型基因片段长度分别约为300和520 bp;AseⅠ酶切pfmdr11042扩增产物,酶切后野生型和突变型基因片段长度分别约为120和250 bp;EcoRv酶切pfmdr11246扩增产物,酶切后野生型和突变型基因片段长度分别约为410和200 bp。

1.7 统计学处理

采用Excel 2003软件建立数据库,定性资料采用率进行统计描述,组间比较用χ2检验或趋势χ2检验及连锁不平衡分析,检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 病例情况

共调查输入性恶性疟原虫患者232例,其中从非洲返回201例(重症38例),东南亚31例(重症3例)。

2.2 Pfcrt和pfmdr1基因各位点酶切结果

恶性疟现症患者血样232例均扩增出Pfcrt和pfmdr1基因。Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点经ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv内切酶酶切,分别检出128、40、12和20例突变,突变型基因DNA片段长度分别约为134、520、250和200 bp()。

基因突变关联性分析

 
图 1 Pfcrt和pfmdr1基因内切酶酶切结果 Figure 1 Restriction enzyme digestion results of Pfcrt and pfmdr1 genes  
 

2.3 恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因位点突变情况